Eline’s Blog 4: Diagnostiek

Als u werkzaam bent in de tandheelkunde, heeft u vast wel eens een parotest uitgevoerd. U gebruikt de paperpoints om het DNA materiaal te verwerven bij de patiënt en stuurt deze vervolgens naar ons op. Enkele dagen daarna krijgt u van ons de uitgebreide uitslag met welke bacteriën aanwezig zijn en in welke hoeveelheid. Maar wat gebeurt er nou precies op het laboratorium?

Als eerste wordt het DNA uit de bacteriën gehaald. Deze worden door middel van een extractievloeistof kapot gemaakt, waardoor het DNA vrijkomt. Het vrijgekomen DNA wordt gezuiverd door een robot. Materiaal dat kan storen in de PCR reactie worden weggewassen.

De hoeveelheid DNA afkomstig van de bacteriën is te klein om het te kunnen kwantificeren, daarom wordt het DNA vermeerderd met behulp van de real-time-PCR. PCR staat voor ‘Polymerase Chain Reaction’ en wordt veelvuldig gebruikt in de medische wetenschap. Als eerst wordt er een PCR-mix gemaakt met daarin de benodigdheden voor de PCR reactie. In deze PCR-mix zitten losse nucleotiden (de bouwstenen van DNA), primers en probes (korte enkelstrengs DNA moleculen) en een enzym die het DNA verlengt. In ons lab gebruiken wij het enzym TAQ polymerase, wat geïsoleerd is uit de bacterie Thermophilus aquaticus. Wij gebruiken dit enzym omdat deze thermostabiel is, wat betekend dat het enzym de grote temperatuurschommelingen van de PCR aan kan en zelfs bij 95 graden kan overleven.

Een PCR programma bestaat uit 3 onderdelen die telkens herhaald worden: denaturatie, hybridisatie en elongatie.
Tijdens de denaturatie wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst in twee enkele DNA strengen, door de samples te verwarmen tot een temperatuur van ongeveer 90-95°C.
Tijdens hybridisatie wordt de temperatuur verlaagd waardoor de DNA-primers aan de enkelstrengs DNA kunnen binden. De primers binden zich aan specifieke nucleotide volgordes, waardoor er onderscheid gemaakt kan worden tussen de bacteriën. Elke bacterie heeft namelijk zijn eigen nucleotide volgorde. Met de primers voor de A.a. bacterie kan ook alleen deze bacterie vermeerderd worden. Daarnaast bind ook de probe aan de DNA streng. Deze probe is fluorescerend.
Vervolgens vindt er elongatie plaats. Het TAQ polymerase gebruikt de losse nucleotiden om het DNA te verlengen. Wanneer het TAQ polymerase een A tegen komt, wordt er een T ingebouwd en bij een C een G. Als het TAQ polymerase de probe tegenkomt, wordt deze geactiveerd en wordt er een fluorescerend signaal afgegeven. Hoe sterker het fluorescerend signaal hoe meer DNA aanwezig is. Zo kan men ‘real-time’, dus elke cyclus, zien hoeveel DNA er gevormd is.

De resultaten van de real-time PCR verwerken we tot de uitslag die we naar u terugkoppelen. Bent u benieuwd hoe zo’n proces nou werkt in het lab? Op de volgende site, http://www.hhmi.org/biointeractive/bacterial-identification-virtual-lab kunt u zelf een PCR uitvoeren en zelfs bekijken wat u gevonden heeft. Erg leuk!